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螢光光譜

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螢光光譜是指某些物質經某波長入射照射後,分子從能級Sa被激發至能級Sb,並在很短時間內去激發從Sb返回Sa,發出波長長於入射光的螢光

螢光光譜原理

設分子能級為基態Sa激發態Sb

分子在能級Sa和Sb上的分布按照波爾茲曼分布規律:

基態上分子數目變化速率為

平衡時(穩定態),上式為0: 又有:

遷移機率(愛因斯坦係數

偶極強度

頻率ν處的入射光強

推導出: Sb通過發射光子從回到Sa的機率,即衰減常數λ

Sb上的分子去激發速率

上式的一個解為

可見激發態上的分子數目以指數形式衰減,衰減常數為Aba Sb輻射壽命為(此處參考指數衰減

此僅當吸收的光子和隨後發射的光子相同時候有效,即全部吸收的光能量通過輻射過程全部發出光子消耗掉。 而實測時激發態壽命很少和上述壽命一致,因為激發態除了直接發射光子外有很多其他途徑失去能量。

Sb通過發出螢光回到Sa的過程的反應速率,即固有螢光速率常數 kF

Sb回到Sa的其他非輻射途徑包括內轉變,系統間轉變,猝熄作用,其速率常數分別為kIC,kIS,kQ[Q] 則Sb總的去激化(熄滅)常數為kF+kIC+kIS+kQ[Q]

螢光量子產率

也可以寫作發射光子數/吸收光子數,即發射的螢光光子數/入射光照射時的吸收量

因為大量的非輻射過程的存在,所以激發態實際衰減時間遠小於理想的輻射壽命τR 描述此動力學過程

此方程的一個解為

Sb是激發態上的分子數

斯托克斯位移

吸收曲線的0,0躍遷與發射曲線的0,0躍遷不重合,之間有一位移,螢光光譜較相應的吸收光譜紅移。 原因是分子在處於激發態期間進行了重定向/重排布,消耗了能量,故螢光光譜的0,0峰向低能量(高波長)方向平移。

螢光強度

得到

觀測發射強度為

k=2.303ld

給一束脈衝入射光後,發射光在脈衝後的時間t時的強度I(t),與激發態的衰減率dSb/dt及激發態通過螢光衰減的比率φF(量子產率)成比例:

隨時間表現為指數衰減

系統內有一種螢光物質時:

系統中有兩種螢光物質時:

Em是螢光強度,上述公式為螢光衰減(decay)公式

內部濾光效應

對高濃度溶液而言,螢光的再吸收不能忽略。大部分入射光在系統前半部分被吸收,發射的螢光被再吸收,只有少量的螢光通過狹縫入射到螢光探測器上,使得探測到的螢光強度減少。

外環境影響

去激發同樣可能由於碰撞或和溶劑分子的混合導致,以速率kQ[Q]發生。和其他過程不同,考慮碰撞時此猝熄是一個雙分子過程。 Sb + Q → Sa + Q (kQ[Q])

因為Q通常濃度遠大於Sb ,此過程被視為一個偽一級反應,kQ[Q]的值可通過變化猝熄劑Q的濃度,觀察對φF的影響測得。芳香類發色基的輻射壽命通常為1*10-9到100*10-9秒。因此,相比較而言,猝熄過程是相當有效率的。普遍的猝熄劑如O2和I-離子,每和激發態分子碰撞一次就會使其去激發一次。此反應速率僅被擴散限制。在微摩爾濃度猝熄劑下,碰撞發生速率為108每秒,因此可以觀察到明顯的猝熄。

τ0可測,以F0/F對[Q]作圖求得kQ

螢光共振能量遷移

簡稱FRET,此過程適用與計算兩端帶發色基的高分子長度。

存在供體D和受體A,當光入射時,激發基態供體Da→Db,Db又去激發,通過共振將能量傳遞給Aa,使得Aa→Ab。

定義遷移效率(E)是Db去激發傳遞能量到Aa占總Db去激發的比例

通過一系列複雜的計算和變化,此處省略,得:

推導出:

這裡R0對一個固定的化學系統而言是常數,R是供體和受體之間的距離,R越接近R0,測計算越精確。

此外計算E的方法有:

參考文獻

  • C.P Cantor & P.R. Schimmel, BIOPHYSICAL CHEMISTRY, Part II. Techniques for the study of biological structure and function. Page 433-465.